1870年8月31日，玛丽亚·蒙台梭利出生于意大利安科纳省一个富裕的上层社会家庭。她的父亲为贵族后裔，是个性格平和、保守的军人；母亲是虔诚的天主教徒，同时博学多识、善良、严谨、开明。作为家中的独生女，蒙台梭利并没有受到家长的溺爱，而是接受了开明的家庭教育，这使得她从小便养成了自律、自爱的独立个性，以及热忱助人的博爱胸怀。
5岁的时候，因为父亲职位的变动，蒙台梭利举家迁往罗马。从此，她开始了自己经历丰富的求学历程。13岁的时候，蒙台梭利做出了一个与众不同的选择——进入工科学校读书，后来她对数学产生了浓厚的兴趣。当时，一般女孩子的教育重点是在品德方面，极少有女孩子进工科学校读书。1886年，16岁的蒙台梭利以优异的成绩从米开朗琪罗工科学校毕业。对数学的热爱，使她在日后提出了“数学心智是培养抽象思考能力的最好途径”的观点。
同年，蒙台梭利进入国立达芬奇工业技术学院，学习自然科学和现代语言学。这为她后来发展语言和自然科学的教育方法奠定了基础。在此期间，由于对生物学的兴趣，蒙台梭利拒绝了父母希望她做一名教师的愿望，而是毅然进入罗马大学学习生物学。在学习生物学的过程中，蒙台梭利又对医学产生了浓厚的兴趣。在当时保守的欧洲社会里，“女子学医”被认为是荒谬和不道德的。父亲也以中断经济来源为要挟，企图阻止蒙台梭利学习医学。但凭着自己坚持不懈的努力，她终于进入医学院学习。由于是班上唯一的女生，蒙台梭利时常独自一人在解剖室里做实验，与尸体独处。家人的反对，沉重的社会压力，孤立的求学环境使得蒙台梭利倍感孤独，但蒙台梭利也因此锻炼出了坚强的毅力和不屈不挠的学术精神，这为她日后献身儿童教育的研究，奠定了坚实的基础。
最终蒙台梭利以医学博士的头衔从罗马大学毕业，成为意大利历史上第一位女医学博士。毕业后的蒙台梭利因为社会的偏见无法独立行医，只好去罗马大学附属医院精神病科做临床助理医生，帮助诊断和治疗智障儿童。在这里，蒙台梭利接触到了有智力缺陷的儿童，当时这些在智力上有缺陷的儿童被视为精神病患者而被关在疯人院。在疯人院的儿童室内没有可供儿童玩耍的玩具，甚至连任何可供儿童抓握和操作的东西也没有，管理人员的态度也极其恶劣，根本不组织这些儿童做任何活动。
蒙台梭利对这些儿童的处境深表同情和忧虑。通过观察和研究，她深深感到，之前的医疗方法不仅无法帮助这些儿童，反而会加速他们智力的下降。怀着对这些儿童的同情和爱心，蒙台梭利对智障儿童的治疗和教育问题产生了兴趣，她决心用自己的知识来改善这些儿童的处境。为此，蒙台梭利深入学习了当时有关儿童心理研究的权威——法国心理学家伊塔和塞根的教育思想和方法。
1799年，在法国南部的森林地带，当地农民发现了一个长期赤身裸体生活在丛林里的野孩。从事儿童教育研究的伊塔担负起了教育这个“阿韦龙野孩”的责任，随后发表了自己的教育成果和研究报告。教育学家塞根则继承了伊塔的事业，提出了“生理教育法”，主张对身体残疾和智力缺陷的儿童进行感官训练，充分挖掘他们的生理潜能，促进其智力和个性的发展。伊塔和塞根的教育思想和方法深深地影响了蒙台梭利，为她自己对智障儿童的研究提供了指导。她认为伊塔和塞根的研究就是“科学的教育学”的先导。
通过对伊塔和塞根在智力缺陷方面研究成果的认真学习，蒙台梭利开始形成自己关于培训这些智障儿童的智力的看法。这加深了她对教育学研究的兴趣，由此她开始大量阅读和研究教育学先驱的著作。其中，法国卢梭的自然主义教育观、瑞士裴斯泰洛奇的民主主义教育思想、德国福禄贝尔的人性教育思想都对蒙台梭利产生了很大的影响，使蒙台梭利认识到幼儿教育在个人发展中的重要作用，以及当前幼儿教育中存在着非常多的错误教学观念和方法。这些认识进一步加深了蒙台梭利对幼儿教育的研究兴趣。这些理论和实践方面的扎实知识，为以后蒙台梭利提出自成一派的教育理论打下了坚实的基础。
由于蒙台梭利的研究，她被罗马国立心理矫正学校聘为校长。在此期间，她将自己的研究成果用在了这些存在智力缺陷的儿童身上，并取得了惊人的成果。经过她的辅导，这些儿童不仅学会了读写，还通过了当时罗马地区为正常儿童举行的公共考试。成功虽然给蒙台梭利带来了大量的荣誉，但她并没有为此所动，而是陷入了沉思：既然这些教育方法在有智力缺陷的儿童身上取得了这么大的成功，那么它们是否也可以用在正常儿童身上呢？在一次演讲中，蒙台梭利说“儿童的智力缺陷主要是教育问题，而不是医学问题”，并向社会呼吁，智障儿童应当与正常儿童一样，享有同等受教育的权利。
为了证明自己的教育方法可以用在正常儿童身上，1901年蒙台梭利毅然辞去校长职务，重回罗马大学，重新注册学习哲学、生物科学、实验心理学和教育学等学科，以便彻底探究人类成长的法则。经过了7年的潜心钻研，她逐渐形成了自己对人类生命发展规律的看法，逐步形成自己的系统的教育思想。
1906年，罗马的优良建筑公会在对贫民窟的建筑进行改造时，邀请蒙台梭利参与新建社区的学校设计。蒙台梭利欣然接受，并按照自己的设想建立了一个类似后来的社区学校和托儿所的育儿场所。1907年1月6日，这个按照蒙台梭利的设想建成的学校在罗马的贫民窟桑伦多区正式成立了，蒙台梭利将它命名为“儿童之家”，招收3～6岁的儿童。在“儿童之家”里，蒙台梭利施行的教育方法和教育理念与以往传统的育儿学校有着很大的区别，并取得了巨大的成功。那些生长于贫民窟的普通的、贫寒的儿童，经过在“儿童之家”的几年学习后，发生了巨大的转变，一个个被培养成了聪明自信、生机勃勃而又富有教养的少年英才。蒙台梭利崭新的、具有巨大魅力的教学方法和教育理念，被各大报纸纷纷报道，很多贵族和政要也前去参观，世界各地的教育机构纷纷邀请她前去讲学和指导——蒙台梭利的思想轰动了整个欧洲和世界。从此“儿童之家”作为蒙台梭利的教育理念的载体，迅速被推广到世界各地，在世界范围内掀起了一场幼儿教育的革命，其影响至今仍长盛不衰。
1929年，“国际蒙台梭利协会”在丹麦成立，协会推选蒙台梭利为会长，十多个国家相继成立了专门研究其教育思想的“蒙台梭利学会”。此后的几十年间，蒙台梭利获得了各个国家颁发的荣誉勋章和各地著名大学的荣誉教授等殊荣。蒙台梭利教育法的特点在于强调儿童早期教育的重要性，尊重和维护儿童的自由。为了使儿童有一个更加美好的未来，为了使社会更加宽容和进步，蒙台梭利从事了半个多世纪的教育实验与研究。由于她在人类文明进步上所做的贡献，1949—1951年蒙台梭利连续3年获得“诺贝尔和平奖”候选人的资格。
1952年5月6日，蒙台梭利在阿姆斯特丹逝世，享年82岁。《西方教育史》称她是20世纪赢得欧洲乃至世界承认的最伟大的进步的教育家。