离开湖南到广州后，1926年1月，毛泽东出席了国民党在广州召开的第二次全国代表大会。会议根据毛泽东等共产党人的建议，通过了农民运动问题的决议案，设立了农民运动委员会，以毛泽东、林祖涵（即林伯渠）、萧楚女等9人为委员。为推动全国农村大革命高潮的到来，1926年5月，毛泽东在广州主办了第六届农民运动进习所，并亲任所长，扩大了招生范围，为全国培养农民运动干部。
这届农讲所，招收学员327人，来自全国20个省区。他们大多是农民运动中的积极分子和有志于农民运动的进步青年学生。学习的课程共有25门，主要是农民问题，还有中国革命各个方面的基本知识。毛泽东亲自讲授《中国农民问题》、《农村教育》、《地理》三门课程。许多教员都是由我党负责实际工作的领导同志兼任。同年9月毕业后，学员们秘密回到全国各地，从事农民运动的组织领导工作。
在主办这届农讲所时，毛泽东就注意到学员的军事训练，在武昌中央农讲所的《规约》中，更赫然写明：“为将来发展农民武装起见，所以要受严格的军事训练”，“不接受这种严格的军事训练，便是对革命没有诚意”。每个学员还发了一支汉阳造七九式步枪，规定每天训练两小时，每周野外军事演习一次。四一二反革命政变发生后，军事训练每天增至4个小时。这期有许多学员在半年后成为各地农民武装起义的骨干。其中有一个叫陈慕平的学员，回乡后在井冈山袁文才的农民自卫军里做事，对以后毛泽东与袁文才会晤起了作用。
1926年冬，随着北伐战争的胜利进军，农民运动势如暴风骤雨，迅速席卷中国中部、南部和北部各省，形成了以湖南为中心的全国农民运动高潮。湖南全省75个县和两个特别区中，已建立县农协或筹备处的有59处，会员136万多，能直接领导的群众600万以上。组织起来的农民，对贪官污吏、土豪劣绅展开了政治、经济、文化等方面的斗争，掀起了翻天覆地的农村大革命。
“农民在乡里造反，搅动了绅士们的酣梦”。地主豪绅、国民党右派、北伐军中的反动军官群起鼓噪，反对农民运动。中共中央局总书记陈独秀也斥责湖南工农运动“过火”。中共中央农委书记毛泽东，再度考察湖南农民运动，用事实驳斥反动派的造谣诬蔑，批评党内右倾机会主义，推动农民运动深入发展。
1926年12月17日，应湖南省第一次工农代表大会电邀，毛泽东从汉口回到长沙，参与会议指导工作。会后，便以国民党中央候补执行委员的身份，在国民党湖南省监察委员会戴晓云陪同下，对湘潭、湘乡、衡山、醴陵、长沙五县农民运动进行了实地考察。
经过历时32天、行程1400多里的考察后，2月12日，毛泽东带着考察湖南各县农运的丰富资料回到武昌，很快写出《湖南农民运动考察报告》，热情歌颂了湖南农民运动的丰功伟绩，彻底批判了党内外一切对农民运动的攻击和责难，对农民在中国民主革命中的主力军作用予以充分肯定，提出了解决农民问题的基本理论和政策，尤其是提出“推翻地主武装，建立农民武装”的论断，为进一步解决无产阶级领导权和同盟军问题提供了理论依据，成为中国共产党领导农民运动的纲领性文件。毛泽东关于农民运动的光辉思想冲破了陈独秀右倾机会主义者的阻挠和压制，迅速传播到全国各地，武装了广大共产党员和工农群众，推动着以湖南为中心的全国农民运动更加猛烈地向前发展。
《湖南农民运动考察报告》写好后，中共湖南区委的机关刊物《战士》周刊，在3月5日出版的第35、36两期合刊和27日的第38期，4月3日的第39期上，首先刊载了全文。接着，《湖南民报》也发表了《报告》全文。这篇《报告》受到了广大共产党员和革命群众的热烈欢迎，然而却遭到了陈独秀及其追随者的反对。《向导》周刊原定刊载《报告》的全文，但却只在3月12日出版的第191期刊登了《报告》的前七部分，后面的第八部分“十四件大事”（占总篇幅的三分之二）则被迫停止刊登了。中共中央委员瞿秋白非常重视这一《报告》，要求连续刊登，陈独秀却大发雷霆说：湖南的农民运动，毛泽东要负主要责任！
但是，真理的声音是封锁不住的。1927年3月，兼管中共中央宣传工作的瞿秋白从上海到武汉得知这篇文章禁止在党中央机关刊物上全文刊登后，十分气愤。经过斗争，他在4月中旬把这篇报告交给共产党领导的长江书店，以《湖南农民革命》为书名，将《报告》出版单行本发行。他还在4月11日亲自为这本书写了序言，热烈赞扬湖南农民运动，称赞毛泽东是“农民运动王”，他说：
“中国农民要的是政权，是土地。因为他们要这些应得的东西，便说他们是‘匪徒’。这种话是什么人说的话！这不但必定是反革命，甚至于不是人！
“农民要这些政权和土地，他们是要动手，一动手自然便要侵犯神圣的绅士先生和私有财产。他们实在‘无分可过’；他们要不过分，便只有死，只有受剥削！
“中国农民都要动手了，湖南不过是开始罢了。
“中国革命家都要代表三万万九千万农民说话做事，到战线去奋斗，毛泽东不过开始罢了。中国的革命者个个都应当读一读毛泽东这本书，和读彭湃的《海丰农民运动》一样。”
正如瞿秋白所预言的那样，《报告》的发表，有力地进一步推动了湖南以及全国农民运动的深入发展。湖南的广大共产党员和工农群众，在《报告》思想的指引下，他们抵制了陈独秀右倾机会主义的错误指令，将农民运动推进到审判与惩治土豪劣绅、建立农民自卫军以及自动起来解决土地问题的新阶段。
毛泽东还在他主办的武昌中央农民运动讲习所里，向来自全国各地800多名学员，系统地讲授了《报告》的内容，并强调我们党应该坚决支持农民起来解决土地问题，使党员深受教育和鼓舞。方志敏从武汉回去时，把《报告》（手抄本）带回江西，向江西，特别是赣东北地区的农运领袖和骨干分子，作了详尽的传达，并组织学习。从此，赣东北地区的农民运动，便很快如火如荼地发展了起来。
身先士卒的总指挥周恩来
突然，一颗炮弹落在附近。周恩来立刻卧倒，全身溅满了泥灰，他毫不在意，掸去身上的泥灰，继续帮助整修工事。一个纠察队员对他说：总指挥，这里是前线，你的指挥位置不在这里。周恩来笑着说：当指挥的怎么能不来？你们不是同样很危险吗？
为了推翻帝国主义和北洋军阀吴佩孚、孙传芳、张作霖的反动统治，在国共合作下，并得到苏联的帮助，1926年7月9日，国民革命军正式出师北伐，很快进展到长江下游流域。
1926年10月和1927年2月，为配合国民革命军出师北伐，上海工人阶级在中国共产党上海区委（亦称江浙区委）的领导下，曾先后举行了两次武装起义，由于准备工作不充分和时机不成熟等原因，都暂时失败了。具有光荣革命传统的上海工人阶级，尽管受到一些曲折和牺牲，并没有气馁，仍然拿出勇气，在积极准备的基础上，争取第三次武装起义。江浙区委罗亦农、赵世炎等，积极支持工人的正义要求，同意举行第三次武装起义，并报告了中央。
当时有人认为举行武装起义既无必要又无把握，担心因此而刺激帝国主义和中国买办资产阶级，引起帝国主义的武装干涉。在此之前被从广东调到中共中央工作、担任中央军委委员的周恩来完全站在上海工人阶级一边，针锋相对地指出，举行第三次武装起义既有必要又有把握，我们的起义是革命，是为了建立上海市民代表政权和建立工人武装，夺取军阀的武装以武装自己，是挽救国民革命危机的重要手段。我们工人现有的武器虽少，但有80万产业工人和广大上海市民的支持，有很多觉悟高的工人纠察队员，只要把准备工作做好，是肯定可以取胜的。至于对帝国主义和中国买办资产阶级来说，没有什么刺激不刺激的问题，你刺激他，他们是反共的，不刺激他，也还是反共的。经过一场激烈的辩论，中央多数同志赞成周恩来的意见，建议由他亲自指挥起义，务获胜利。
周恩来当时任黄埔军校的政治部主任，又是国民革命第一军的政治部主任，参加过两次东征的指挥和平息过广州反动商团暴动，是我党最有实践经验的军事指挥员之一。
中央会议后，周恩来就来到了江浙区委，参与领导起义的准备工作。他亲自参加上海各区区委书记联席会议，了解各区工人纠察队的力量配备，研究敌军警的据点和力量分布情况，并制定了第三次武装起义的部署方案。
3月中旬，原驻上海的军阀李宝章部悄悄撤走，由直鲁联军的毕庶澄部接防。当时，北伐军的东路军已过松江，紧逼上海，毕庶澄部士气低落，纪律松弛。周恩来抓住这一有利时机，指出武装起义的时机已经成熟。江浙区委根据周恩来的建议，决定在3月21日举行第三次武装起义。
3月21日，天气晴朗，和煦的阳光普照大地，到处充满一片生机。中午12时，工厂和轮船的汽笛齐鸣，宣告上海80万产业工人总罢工和第三次武装起义正式开始了。顿时，租界上的劳动大众潮涌般地向华界指定地点集合，华界的武装工人纠察队则带着红袖章，雄赳赳、气昂昂地走上战斗岗位。
起义的行动，分南市、闸北、虹口、浦东、沪西、沪东、吴淞七个区。参加行动的工人纠察队队员有5000多人。前线总指挥部设立在宝山路横浜桥南的商务印书馆职工医院内。在前线负责指挥的是周恩来和赵世炎。
当天清晨，周恩来和赵世炎进入总指挥部。据当时在场的中共闸北区委委员黄澄镜（逸峰）回忆：“周恩来同志身穿一身灰布棉袍，头戴一顶鸭舌帽，围了一条深灰色围巾，西装裤子黑皮鞋，完全是一个地下工作者的形象。”他在总指挥部里，和赵世炎一道，一会儿伏在桌子上，对着上海市区地图，边指划边商量，一会儿和外面进来的联络员交谈，听取报告，指挥行动。他还亲临现场，往返于火车站、东方图书馆、商务印书馆三路指挥战斗。
起义发展得十分迅速。当时毕庶澄部的鲁军为了便于撤退，主要集中于火车站所在的闸北区。所以，其他地区的战斗都比较顺利。南市最早打下，工人纠察队先取下警察局，再占领高昌庙和南火车站，并缴获了警察的枪支。浦东在两小时内也拿了下来。吴淞由铁路工人和纱厂工人占领。他们缴获了大量武器，武装徒手的工人纠察队员。到下午4时，闸北以外的各区先后取得胜利。
这时，斗争焦点集中到敌军兵力厚集的闸北区。敌军在闸北共设有20多个据点，其中主要的是：北火车站，商务印书馆俱乐部（东方图书馆），湖州会馆和三处警察署。当天4时前，湖州会馆和三处警察署的敌人先被解决。周恩来把指挥机构迁到第五区警察署。
4时左右，吴淞部委送来一个重要情报：敌军毕庶澄部500人左右，全副武装，并有轻机枪数挺，于早晨乘一列铁棚车开往吴淞，准备从海上逃跑；列车到达吴淞附近时，发现吴淞已被工人纠察队占领，掉头返回上海。周恩来接到这个情报后，立刻召集会议研究。在会上，他当机立断地说：“不能让这一列车进入上海。如让他进来，第一，会冲破我们的虬江路防线；第二，列车上的武装进入北站（按：指北火车站），将增加我们攻击的困难。”他指着地图宣布：选择接近市区的天通庵车站附近组织伏击。并亲自率领工人纠察队第一中队和第四中队一个小队到天通庵勘察地形，布置兵力。他经过仔细观察后，找到住在那里的老扳道工鲁大爷和他的儿子把路轨的道钉拔掉，又将队伍分为两支，选择有利地形，埋伏在铁路两侧。
黄昏前后，列车进入伏击圈，火车因道钉被拔而突然出轨翻倒。埋伏在铁路两侧的工人纠察队，立刻以密集火力猛烈射击。列车上的敌人毫无准备，又因车门被关闭反锁，无法打开，只能在窗口抵抗。不久，沪东和虹口的工人纠察队也赶到，投入战斗。天黑后，敌军一部分士兵下了车，坚守待援。周恩来又命令一部分学生纠察队投入战斗，并发动政治攻势，高喊“缴枪不杀”，“赶快投降”。经过一夜战斗，敌军兵心逐渐涣散，火力转弱。到第二天中午，除少数人溜走外，其他400多人挂起白旗，丢出枪支，全部被俘。周恩来命令用缴获的武器弹药来武装徒手的纠察队，并将其中的轻机枪调拨给正在围攻北站的纠察队，以增强战斗力。