永嘉丧乱，西晋王朝覆灭，晋室南迁，建立东晋政权。广大北方地区出现了“五胡”、“十六国”的混战、割据局面。魏晋时期的河西地区先后建立了前凉、后凉、南凉、西凉、北凉等封建政权。前凉张骏时期，曾改敦煌为沙州。公元400年，李暠据敦煌称王，建立西凉国。敦煌有史以来第一次成为国都，以后亡于北凉。前凉、西凉、北凉三政权先后统治河西地区时，比较注重谨修内政，安民保境，轻徭薄赋，劝课农桑，崇尚儒学，兴办教育。使河西地区社会安定，经济繁荣，文化昌盛。
这一时期，凉州已成为中国北部的文化中心，而敦煌又是凉州文化的中心，名流学者代不乏人。如有号称“敦煌五龙”的索靖、汜衷、张彪［虎中加甘］、索纟介、索永，俱以文学闻名当时。索靖还是历史上著名的书法家。敦煌的经学大师宋纤、郭瑀、刘昞等，讲学授徒数百人到上千人，敦煌人阚骃撰写的《十三州志》，是我国古代重要地理著作。还有天文学家赵匪文［匪文为一字］及索袭、宋繇、张湛等敦煌较知名的学者。
十六国时期，群雄逐鹿中原，战火四起，百姓流离失所，处于水深火热之中，而河西成为相对稳定的地区。中原大批硕学宿儒和百姓纷纷背井离乡，逃往河西避难，带来了先进的文化和生产技术。尤其汉魏传入的佛教在敦煌空前兴盛。饱受战争之苦的百姓拜倒在“佛”的脚下，企望解脱苦难，过上幸福、安定的生活。敦煌是佛教东传的通道和门户，也是河西地区的佛教中心。有一大批佛学高僧在敦煌讲经说法。河西各地的佛门弟子多来此地研习佛学。如有世居敦煌的译经大师竺法护；有前往印度学习佛法的敦煌人宋云等。法显、鸠摩罗什等佛学大师无论东进还是西去都在敦煌留下了他们的足迹。前秦建元二年（公元366年〕，乐僔和尚在三危山下的大泉河谷首开石窟供佛，莫高窟从此诞生了。之后，开窟造佛之举延续了千百年，创造了闻名于世的敦煌艺术。
北魏灭了北凉，统一了北方，占据了河西。这个时期，敦煌比较安定，百姓安居乐业，佛教随之盛行。北魏在莫高窟开凿洞窟13个。